Cinétique
Pour une réaction simple, la vitesse de formation de B (ou de disparition de A) est proportionnelle à la concentration de A:
Vitesse de réaction: d[B]/dt = - d[A]/dt = k1[A] (constante de vitesse)
Comme la réaction inverse a aussi lieu, le changement de [B] dépend de la différence des deux vitesses de réaction:
d[B]/dt = - d[A]/dt = k1[A] - k-1[B]
Equilibre: d[B]/dt = - d[A]/dt = 0
Donc, à l'équilibre: k1[A]eq = k-1[B]eq
[B]eq / [A]eq = k1/ k-1 = Keq (constante d'équilibre)
Réaction catalysée par une enzyme
Il y a au moins trois réactions simples:
1. Fixation du substrat (S) sur l'enzyme (E), formation du complexe (ES)
2. Transformation du substrat lié (ES) en produit lié (EP)
3. Dissociation du complexe (EP), largage du produit (P)
Pour chaque réaction il y a une différence d'énergie libre et une barrière d'activation à franchir. A chaque constante de vitesse correspond une énergie d'activation (plus DEa est grande, plus k est petite):
La différence d'énergie libre (DG) entre substrat et produit ne dépend pas de l'enzyme. L'équilibre n'est donc pas modifié par l'enzyme!
Ici aussi, la vitesse de réaction est difficile à mesurer en présence de S et P, surtout à l’équilibre!
On mesure donc de préférence en déséquilibre total, c’est-à-dire la vitesse initiale:
En début de réaction, il n'y a pas de P, et on présume que le complexe EP se dissocie plus vite qu'il ne se forme à partir de ES, c'est-à-dire que k3 > k2, k-2 . La réaction qui limite la vitesse de formation de P est la réaction k2. Dans ces conditions, le schéma se simplifie:
Leonor Michaelis et Maud Menten ont déduit de ce modèle en 1913 une équation qui prédit la vitesse initiale (de formation de P )en fonction de la concentration du substrat:
Vitesse initiale de la réaction: vo = d[P]/dt = k2·[ ES ]
La vitesse de réaction dépend de la concentration du complexe enzyme-substrat ES.
Il faut donc calculer la concentration de ES:
ES se forme à partir de E + S et se décompose soit en E + S , soit en E + P .
Vitesse de formation de ES: vf = k1·[ E ]·[ S ]
Vitesse de dégradation de ES: vd = (k-1+ k2)·[ ES ]
[ ES ] atteint rapidement une valeur constante (condition dite de "steady state"),
donc vd = vf
(k-1+ k2)·[ ES ] = k1·[ E ]·[ S ]
[ ES ] = [ E ]·[ S ] k1/ (k-1+ k2) = [ E ]·[ S ] / KM
KM = (k-1+ k2) /k1 = constante de Michaelis (-Menten)
Il faut maintenant connaitre la concentration de l'enzyme libre [ E ].
[ E ] = [ E ]T - [ ES ]
où [ E ]T est la concentration totale d'enzyme, libre ou lié. On a donc:
[ ES ] = ([ E ]T - [ ES ])·[ S ] / KM = [ E ]T·[ S ] / KM - [ ES ]·[ S ] / KM
[ ES ] + [ ES ]·[ S ] / KM = [ E ]T·[ S ] / KM
[ ES ]·( 1 + [ S ] / KM ) = [ E ]T·[ S ] / KM
[ ES ]·(KM + [ S ]) / KM = [ E ]T·[ S ] / KM
[ ES ]·(KM + [ S ]) = [ E ]T·[ S ]
[ ES ] = [ E ]T·[ S ] / (KM + [ S ])
On peut enfin introduire ce terme dans l'équation pour la vitesse initiale:
vo = k2·[ ES ] = k2·[ E ]T·[ S ] / (KM + [ S ]) = vmax·[ S ] / (KM+ [ S ])
Equation de Michaelis-Menten
Cas spéciaux ou extrêmes
[ S ] >> KM vo = vmax·[ S ] / [ S ]
vo = vmax
vo indépendente de [ S ],
saturation, asymptote
[ S ] << KM vo = vmax·[ S ] / KM dépendence linéaire de [ S ],
substrat limitant, asymptote
[ S ] = KM vo = vmax· KM / 2 KM
vo = vmax / 2
demi-saturation de l'enzyme
Graphe de Michaelis-Menten: vo en fonction de [ S ]
http://www.unine.ch/bota/bioch/cours/enzymes/graphMM.gifvmax est la vitesse maximale que peut atteindre la réaction lorsque l'enzyme est saturée de substrat,
c'est-à-dire lorsque [ E ]T = [ ES ].
KM est la concentration de substrat qui sature l'enzyme à moitié.
C'est une mesure de l'affinité de l'enzyme pour le substrat: plus l'affinité est élevée, plus KM est petit.
k2 (= vmax/ [ E ]T) est souvent appelée constante catalytique kcat, et représente le nombre de cycles catalytiques par seconde (nombre de rotations) dont est capable l'enzyme.
Le rapport kcat/KM est souvent aussi donné comme mesure de l'efficacité catalytique, car il correspond à une constante de vitesse pour de basses concentrations de substrat ( [ S ] << KM, donc [ E ] = [ E ]T)
vo = vmax·[ S ] / KM = kcat·[ E ] ·[ S ] / KM =[ E ] ·[ S ] · kcat/KM
Linéarisation de l'équation de Michaelis-Menten
Il est difficile de placer correctement à la main une hyperbole dans un graphe. On se trompe très facilement sur la hauteur de vmax . Pour simplifier l'évaluation des résultats, on utilise une transformation de l'hyperbole en droite. La plus connue est la transformation en double-réciproque de Lineweaver et Burke:
1 / vo = 1 / vmax + (KM / vmax )· 1 / [ S ]
Cette équation représente une droite de pente KM / vmax
L'intersection sur l'axe vertical est 1 / vmax et sur l'axe horizontal 1 / KM .
Graphe de Lineweaver-Burk: 1/vo en fonction de 1/[ S ]
http://www.unine.ch/bota/bioch/cours/enzymes/graphLB.gifCette représentation permet d'estimer les constantes à l'aide de papier millimétré et d'une règle. Elle a cependant le défaut de donner trop de poids aux valeurs expérimentales les plus imprécises, celles des plus petites concentrations de substrat (voir exercice 1)
Bien qu'il soit de nos jours possible (et statistiquement plus correct) d'ajuster par ordinateur une courbe hyperbolique aux points expérimentaux, la présentation selon Lineweaver et Burk est encore souvent utilisée pour présenter des résultats (par ex. en insert d'un graphe de Michaelis-Menten) car ils donnent une impression immédiate de la qualité des mesures expérimentales.
Unités d'activité enzymatique
Unité officielle: katal (kat), quantité d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 mole de substrat par seconde. Le katal n'est jamais utilisé, car beaucoup trop grand. On doit utiliser des sous-unités comme les µkat (10-6 katal), nkat (10-9 katal) ou pkat (10-12 katal).
La plupart des biochimistes préfèrent l' "unité internationale" (IU, International Unit), qui est la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 µmole de substrat par minute. 60 IU valent donc 1 µkat.
Le nombre de rotations ( kcat ) est le nombre de molécules de substrat transformées par molécule d'enzyme par seconde (ou le nombre de moles de substrat transformé par mole d'enzyme.
On peut aussi calculer l'activité molaire, le nombre de moles de substrat transformé par mole d'enzyme par minute (kcat x 60).
Si on connait pas le poids moléculaire de l'enzyme, on peut quand même mesurer l'activité spécifique , soit l'activité par mg de protéine purifiée. Normalement, elle est donnée en IU/mg protéine (ou µkat/mg).
Si on calcule l'activité spécifique sur un extrait non-purifié (soit un mélange de protéines), elle indique la pureté d'une enzyme.
Au cours d'une purification d'enzyme, on mesurera donc régulièrement:
l'activité totale (IU ou µkat)
la quantité totale de protéines (mg)
et le volume total de solution (ml).
De ces trois valeurs, on pourra calculer:
l'activité spécifique (activité totale / quantité totale de protéine, IU/mg),
le rendement (activité totale / activité totale avant la première étape de purification)
et le taux de purification (activité spécifique / activité spécifique avant la première étape de purification).
L'activité spécifique et le taux de purification atteigne une valeur maximale lorsque l'enzyme est pure
